La microsporidiosis en camarones causa crecimiento retardado y vulnerabilidad inmunológica ante otros agentes infecciosos. Se han identificado hasta once tipos de microsporidios, entre los cuales la microsporidiosis hepatopancreática (MH), causada por Enterocytozoon hepatopenaei (EHP), destaca como la de mayor atención en Peneidos . Para mitigar su efecto y propagación, se ha desarrollado múltiples metodologías basadas en PCR y qPCR. No obstante, algunos de estos ensayos han demostrado ser poco selectivos. Se ha reportado que las metodologías basadas en el gen SSU-rRNA presentan reacciones cruzadas con microsporidios acuáticos estrechamente relacionados lo que las hace poco recomendables para la detección de EHP. Esta limitación quedó en evidencia en octubre de 2022. Camarones P. vannamei de tres granjas en Costa Rica presentaron signos de infección por EHP. Se tomaron muestras y se analizaron con dos metodologías de PCR basadas en SSU-rRNA , detectando un microsporidio hepatopancreático similar a Vittaforma, previamente desconocido. Estos resultados sugieren que dichas metodologías podrían generar falsos positivos al no diferenciar este microsporidio de EHP .
Las muestras fueron compuestas por agrupaciones (pool) de 5 submuestras de hepatopáncreas. Lo s tejidos se preservaron en etanol al 95 % . P ara los ensayos moleculares, el ADN fue rescatado de ~ 30 mg de muestra con reactivos comerciales e instrucciones del fabricante (DNeasy ® Blood & Tissue | Qiagen®).
La amplificación por PCR convencional se llevó a cabo en un volumen total de 25 µl que contenía 1 µl de ADN molde (50-2 00 ng/µl), 12,5 µl de DreamTaq ™ Green PCR Master Mix (2X) (Thermo Scientific™) y 0,4 µM de cada cebador . Las condiciones de la PCR consistieron en una desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 min, seguida de 35 ciclos a 95 °C durante 3 0 s, temperatura de alineamiento (TM °C) durante 3 0 s y 72 °C durante 3 0 s con un paso de extensión final a 72 °C durante 7 min. Los productos de la PCR se procesaron en un gel de agarosa al 1,2 % y se visualizaron en un UVP GelSolo (Analytik Jena).
Los productos positivos fueron secuenciados con el método de Sanger. El análisis de la secuencia de l as amplificaciones reveló un tamaño de fragmento de 482 pb (OQ331021) con una identidad del 97,1% y 92,3% con un microsporidio no caracterizado (MF374875) y Vittaforma corneae